ESAMI DIAGNOSTICI INFERTILITA'

CARIOTIPO SU SANGUE PERIFERICO

Circa il 10-15% degli uomini con azoospermia o oligospermia è portatore di un’anomalia cromosomica.

Allo stesso modo, circa 10-15% delle donne con amenorrea (primaria o secondaria), aborti ricorrenti o con infertilità è portatrice di un’anomalia cromosomica. In entrambi i casi queste anomalie sono evidenziabili tramite l’analisi del cariotipo.

Che cos’è il cariotipo?

Il cariotipo è l’assetto cromosomico di un individuo, cioè l’insieme dei suoi cromosomi, (presenti nel nucleo delle cellule), strutture che contengono il DNA e quindi l’informazione genetica.

Cosa sono i cromosomi?

• Il corredo cromosomico di una persona deriva per il 50% dalla madre (gamete femminile: cellula uovo) e per il 50% provengono dal padre (gamete maschile: spermatozoo).
• Durante il concepimento, uno spermatozoo con 23 cromosomi si unisce con un ovulo, che ne contiene altri 23, per dare vita ad un essere umano dotato di 46 cromosomi. Se il gamete maschile porta il cromosoma X nascerà una femmina, mentre se porta il cromosoma Y nascerà un maschio.
• Il cariotipo di una femmina normale sarà, quindi, 46,XX, mentre quello di un maschio 46,XY.

Che cos’è l’esame del cariotipo?

È un esame di laboratorio che comporta la visualizzazione al microscopio dei cromosomi contenuti nelle cellule di un individuo. Questo esame può essere condotto a partire da tutti i tipi di cellule: per comodità, dopo la nascita lo si fa di solito a partire dai linfociti (un tipo di cellule del sangue).

Come viene eseguito?

Per l’analisi del cariotipo, le cellule vengono bloccate in un momento particolare della divisione: la metafase. In questa fase, i cromosomi si presentano come strutture ben definite, facilmente individuabili e riconoscibili al microscopio.
L’esame del cariotipo prevede, quindi, le seguenti fasi:

• Prelievo del campione e crescita in coltura in un terreno arricchito, tale da promuovere la divisione cellulare in vitro.
• Isolamento dei cromosomi dal nucleo delle cellule e posizionamento degli stessi su un vetrino.
• Colorazione con sostanze specifiche che si fissano selettivamente a determinate zone cromosomiche, dando luogo a un caratteristico aspetto a bande (Q, G o R, secondo la tecnica utilizzata).
• Osservazione al microscopio: i cromosomi vengono contati, analizzati e fotografati.

Ricostruzione, in maniera analoga a quanto viene fatto per un puzzle, dell’immagine dei cromosomi. Le coppie vengono appaiate a due a due, in base alle dimensioni (dal più grande

Questo esame è in grado di rilevare:

• La presenza di alterazioni di numero o di struttura dei cromosomi sessuali (cromosoma X, cromosoma Y) che possono essere associati a patologie dello sviluppo sessuale (sindrome di Turner, sindrome di Klinefelter) normalmente causa di infertilità;
• La presenza di riarrangiamenti cromosomici bilanciati presenti in individui clinicamente sani, che possono essere la causa di infertilità o ridotta fertilità e generare poliabortività o nascita di bambini affetti da patologie cromosomiche.

L’analisi del cariotipo su sangue periferico è fortemente raccomandata durante il processo diagnostico, soprattutto nei soggetti con oligo o azoospermia e prima della riproduzione in vitro.

Consigliamo l’analisi del cariotipo ai pazienti di sesso maschile:

• Con azoospermia o oligospermia
• Normospermici dopo un anno di tentativi infruttuosi per l’ottenimento di una gravidanza

Consigliamo l’analisi del cariotipo alle pazienti di sesso femminile:

• Dopo un anno di tentativi infruttuosi per l’ottenimento di una gravidanza
• Con amenorrea primaria o secondaria
• Con insufficienza ovarica
• Con aborti ricorrenti

 Che cosa si vede esattamente?

L’esame del cariotipo permette di individuare due tipi di anomalie cromosomiche:

1. Anomalie numeriche, vale a dire la presenza di un numero diverso di cromosomi (in più o in meno) rispetto ai 46 caratteristici dell’essere umano. Sono un esempio di anomalie numeriche le trisomie, che comportano la presenza di tre copie di uno stesso cromosoma (invece di due): è il caso della trisomia 21 (sindrome di Down), della trisomia 18 (sindrome di Edwards) o della trisomia 13 (sindrome di Patau).

Un altro esempio sono le monosomie, cioè la presenza di un cromosoma in meno, come nel caso della sindrome di Turner, in cui c’è un solo cromosoma sessuale (X), ma manca il secondo.

A eccezione di quelle che riguardano i cromosomi sessuali (X e Y), le anomalie numeriche dei cromosomi hanno sempre conseguenze importanti sull’individuo affetto: molto spesso, addirittura, la gravidanza di un embrione con anomalie nel numero dei cromosomi si interrompe precocemente.

2. Anomalie strutturali, che riguardano appunto la struttura del cromosoma. Si distinguono:
   – delezioni: perdita di un frammento di cromosoma;
   – inversioni: distacco di un frammento di cromosoma, che si inserisce di nuovo nello stesso punto, ma ruotato di 180 gradi;
   – duplicazioni; raddoppio di un frammento di cromosoma;
   – traslocazioni: scambio di un frammento genetico tra due cromosomi diversi. Se durante lo scambio non si verificano perdite o duplicazioni di materiale genetico, la traslocazione è detta bilanciata e ha come unica conseguenza una difficoltà di procreazione, oppure può favorire abortività multipla. In generale, comunque, anche le anomalie strutturali sbilanciate, come quelle di numero, comportano conseguenze piuttosto importanti.

Che cosa non si vede con l’esame del cariotipo?

L’esame non permette di individuare singoli “errori” del patrimonio genetico (mutazioni), e quindi non permette di identificare malattie genetiche causate da questi errori. Per esempio, malattie come la talassemia, che dipende da mutazioni in uno dei geni della globina.

Prima del prelievo, non è necessario il digiuno.

FIBROSI CISTICA

La fibrosi cistica (FC) è una grave malattia ereditaria, cronica, evolutiva; un bambino ogni 2700 nasce con questa malattia. Il gene responsabile della fibrosi cistica viene localizzato nel cromosoma 7 e codifica una proteina (CFTR) la cui funzione è regolare il passaggio di ioni attraverso la membrana cellulare, questa funzione viene alterata quando il gene presenta una mutazione. In Italia c’è un portatore sano ogni 25 persone circa. La coppia di portatori sani, a ogni gravidanza, ha una probabilità su quattro di avere un figlio malato.

Nella popolazione caucasica è la più diffusa, con una incidenza di 1 malato ogni 2500-2700 nati vivi. Nei pazienti affetti da FC le secrezioni delle ghiandole esocrine, (cioè i liquidi biologici come il muco, il sudore, la saliva lo sperma, i succhi gastrici) sono molto più dense e viscose del normale. I problemi più gravi sono a carico dei polmoni, dove il muco estremamente denso può causare problemi respiratori e infezioni. Anche i succhi pancreatici sono più densi del normale, causando problemi digestivi. La malattia si manifesta per lo più entro i primi anni di vita, talora più tardivamente, e può esprimersi con maggiore o minore gravità in individui diversi. Pertanto viene trattata con terapie che variano da soggetto a soggetto, costituite per lo più da fisioterapia, antibiotici, aerosol-terapia, estratti pancreatici e vitamine. Il decorso e la prognosi della fibrosi cistica sono notevolmente migliorati negli ultimi decenni, soprattutto per i pazienti diagnosticati precocemente. Nonostante ciò, allo stato attuale la guarigione non è possibile e la durata media della vita è comunque ancora ridotta rispetto a quella della popolazione generale.

Nella fibrosi cistica il liquido seminale è in genere diminuito di quantità e ha caratteristiche di composizione diversa rispetto al normale (ad esempio contiene minori quantità di una sostanza chiamata fruttosio). Ma quello che è importante è che nella maggior parte dei casi (si stima nel 95-98%, ma non ci sono dati certi) non contiene spermatozoi, una condizione chiamata nel linguaggio medico “azoospermia” e che questa comporta che non possano avere figli per via naturale.

La ragione di questo è che le parti dell’apparato genitale maschile destinate a portare all’esterno gli spermatozoi non sono in genere normalmente sviluppate. Queste parti si chiamano “dotti deferenti”: si dice che esiste nella maggioranza dei casi una condizione di “atresia (= assenza ) congenita (= presente dalla nascita) dei dotti deferenti” (in gergo internazionale la sigla è CBAVD), i canali attraverso i quali gli spermatozoi prodotti nei testicoli fuoriescono all’esterno. I testicoli invece si sviluppano normalmente e producono normalmente ormoni sessuali maschili; di conseguenza lo sviluppo sessuale, le caratteristiche sessuali del corpo, l’erezione e le altre caratteristiche dell’attività sessuale sono normali; i testicoli producono anche spermatozoi che però, per l’assenza dei dotti deferenti, rimangono depositati al loro interno. Vi è oggi la possibilità di prelevare gli spermatozoi presenti nel testicolo (con un ago attraverso la cute o con una tecnica di microchirurgia, detta MESA) e utilizzarli per una fecondazione in vitro, cioè per fecondare in provetta gli ovociti prelevati dalla partner e, una volta fecondati, inserirli nell’utero per avviare una gravidanza. La percentuale di successo di questa procedura, con conseguente gravidanza e nascita di un bambino, risulta essere intorno al 25% in caso di patologie diverse dalla FC nelle quali ha una rilevante applicazione.

Ad oggi sono state ritrovate più di 1500 mutazioni a carico del gene della fibrosi cistica. Alcune mutazioni sono più diffuse in alcune popolazioni piuttosto che in altre e variano anche tra le diverse regioni italiane. 

Fibrosi cistica ed infertilità

Nel maschio

• Nei maschi, il 95% dei pazienti adulti con fibrosi cistica mostra azoospermia per atresia dei dotti deferenti.
• Alcuni studi hanno inoltre evidenziato che la frequenza delle mutazioni in eterozigosi (solo una delle due copie di un gene è alterata) del gene CFTR è due volte superiore negli uomini infertili rispetto alla popolazione generale.

È noto che la proteina CFTR è espressa nel tratto riproduttivo maschile (epididimo, cellule del Sertoli), ed anche sullo spermatozoo, sebbene la sua funzione non sia completamente chiarita.

Nella donna

La fibrosi cistica può influenzare la viscosità del muco cervicale o, nelle gravi condizioni cliniche, interferire con i cicli mestruali. Recentemente nuovi studi stanno ipotizzando che la fibrosi cistica possa alterare l’ambiente uterino e tubarico (disgregolazione di HCO3-), andando ad impedire il corretto trasporto degli spermatozoi ed il processo di capacitazione dello spermatozoo e quindi la fecondazione in vivo. La proteina CFTR si ritrova, infatti, nella maggior parte dei distretti del tratto riproduttivo femminile (vagina, cervice, utero, tube) e la sua espressione è modulata dal ciclo ormonale (aumenta con gli estrogeni e diminuisce con il progesterone). L’overespressione della proteina nella prima fase del ciclo è necessaria per massimizzare la secrezione dei fluidi che trasportano gli spermatozoi nelle tube e per incrementare i livelli di HCO3-, necessari per il processo di capacitazione. Nella seconda fase del ciclo, al contrario, i fluidi devono ridursi per permettere l’impianto della blastocisti.

Esistono vari tipi di test genetici per identificare nel DNA le mutazioni del gene della fibrosi cistica:

• test di 1° livello: identificano un certo numero di mutazioni (da 31 a 200) che sono le  più frequenti;
• test di 2° e 3° livello: studiano l’intero gene osservando anche le  mutazioni più rare.

Allo stato attuale si può stimare che in Italia un test di 1° livello sia in grado di diagnosticare circa dal 75 al 90% delle mutazioni del gene FC.

Come si esegue l’analisi genetica per la Fibrosi Cistica?

ll test per individuare i portatori delle mutazioni a carico del gene CFTR è un test genetico eseguibile a partire da un prelievo di sangue L’unico modo per identificare i portatori sani è quello di effettuare un test sul DNA alla ricerca di mutazioni nel gene della FC. L’analisi però è complicata dal fatto che esistono numerosissime mutazioni (ad oggi oltre 900) che causano la FC; molte di esse sono rare, molte altre ancora sconosciute. Generalmente, il test genetico viene eseguito tenendo conto di 31-200 mutazioni (a secondo del tipo di analisi effettuata), scelte fra le più frequenti nell’area geografica in questione e che nel complesso permette di identificare circa 90 per cento dei portatori. Il test genetico non è in grado di identificarle tutte. In casi particolari, adeguatamente valutati dal genetista, può essere eseguito anche un test genetico che prevede l’analisi di mutazione dell’intero gene, con conseguente ricerca di tutte le mutazioni sinora scoperte.

Quando i malati di fibrosi cistica desiderano ampliare la famiglia dovranno richiedere un consiglio medico e genetico. Lo specialista gli suggerirá di ampliare lo studio genetico a entrambi i membri della coppia e se la diagnosi è positiva gli indicherà le opzioni che dispongono, la diagnosi prenatale o quella preimpianto.

La Diagnosi Genetica Preimpianto (DGP) è una tecnica di riproduzione assistita che ci permette selezionare gli embrioni sani per la fibrosi cistica, embrioni che potranno essere trasferiti all’utero materno, permettendo così la nascita di bambini liberi da questa malattia.

Che risultati può dare l’analisi genetica per la Fibrosi Cistica?

A seguito dell’analisi genetica per Fibrosi Cistica si possono ottenere due tipi di risultati:
– l’analisi può individuare nel DNA del paziente la presenza di una mutazione a livello di una copia del gene CFTR, mentre l’altra copia è normale.
Si dice che il soggetto risulta portatore in eterozigosi di quella mutazione, e questo risultato significa che il paziente è un PORTATORE SANO.
– l’analisi può individuare nel DNA del paziente la presenza di mutazioni in entrambe le copie del gene CFTR.
Si dice che il soggetto risulta eterozigote composto (due mutazioni diverse) o omozigote (due mutazioni uguali) di quella/e mutazione/i; questo risultato significa che il paziente è un AFFETTO da Fibrosi Cistica.
– l’analisi genetica non individua nel DNA del paziente la presenza di mutazioni del gene CFTR.
Si dice che il soggetto risulta “NEGATIVO”. Questo risultato significa che il soggetto ha una diminuita, rispetto a prima dell’analisi, di essere un portatore.
Non è possibile che l’analisi escluda in assoluto la probabilità di essere un portatore, perchè non è possibile escludere la presenza di tutte le numerosissime mutazioni del gene della fibrosi cistica.

E’ importante ricordare che:
– la probabilità di essere un portatore di fibrosi cistica è maggiore per un soggetto che sia parente di un malato o di un portatore.
In questo caso è necessario prima identificare la mutazione del malato o del portatore presente in famiglia (mutazione “familiare”) e poi ricercarla nel parente. Se il parente risulta non avere nel suo DNA la mutazione familiare, la sua probabilità di essere portatore diventa estremamente bassa.
– la probabilità di essere portatore di fibrosi cistica è minore ma comunque presente anche nel soggetto che non è parente di un malato o di un portatore. In questo caso, per chi si sottopone alla ricerca delle più frequenti mutazioni del gene della fibrosi cistica e non risulta avere nel suo DNA nessuna di queste, la probabilità di essere portatore diventa bassa (anche se non zero).

Prima del prelievo, non è necessario il digiuno.